e0r
Słowo ode mnie: praca Pana Chrostowskiego jest tak bardzo ciekawa, że poświeciłem 3 dni na wklepanie tego na kompa, ale chyba warto i mam nadzieję, że zainteresuje ona nie tylko najbardziej ambitnych ludzi z tego działu, ale też poprostu zwykłych ciekawskich zjadaczy chleba, gdyż w większości jest napisana bardzo przystępnym językiem. Polecam 
Krzysztof Chrostowski - Postępy diagnostyki antydopingowej
Precyzyjne wykrywanie oraz identyfikacja niedozwolonych środków dopingujących w organizmie sportowców, uczestniczących w zawodach (a także wyrywkowo, w trakcie kontroli poza zawodami), jest zasadniczym elementem współczesnego systemu przeciwdziałania dopingowi w sporcie. Wynika to z przyjętej obecne definicji dopingu, według której podstawowym kryterium diagnostycznym i dowodowym stosowania niedozwolonych środków jest stwierdzenie w moczu sportowca określonego związku lub jego metabolitu, bądź też przekroczenie dopuszczalnego progu (limitu) jego stężenia. Obecnie w laboratoriach antydopingowych, poza analizami moczu, przeprowadzane są również badania próbek krwi i innych materiałów badawczych (np. włosów).
Stąd też wynikają wysokie wymagania stawiane badaniom, prowadzonym w laboratoriach antydopingowych, oraz dążenie do stałego udoskonalania metod wykrywania oraz identyfikacji zakazanych związków.
Wysiłki zmierzające w tym kierunku przyniosły, w ciągu ostatnich lat, szereg nowych rozwiązań w dziedzinie techniki instrumentalnej i analitycznej. Dzięki temu znacznie rozszerzyły się możliwości badań analitycznych, a uzyskane wyniki stały się wiarygodne. Warto przeto, choćby pobieżnie, zapoznać się z aparaturą badawczą nowej generacji, stanowiącą zasadnicze wyposażenie czołowych laboratoriów antydopingowych. Spośród nowych rozwiązań i innowacji technicznych pragnę ukazać trzy rodzaje aparatów, których zastosowanie okazało się wyjątkowo korzystne.
Jednym z trudniejszych problemów, które należało rozwiązać w toku badań antydopingowych było rozróżnienie endogennych androgenów, takich jak testosteron, dihydrotestosteron (DHT) i dehydroepianarosteron (DHEA), od ich syntetycznych pochodnych, stosowanych w celach dopingowych. Na podstawie wyników rutynowych analiz antydopingowych nie można było rozstrzygnąć, czy związki, ujawnione w moczu badanego sportowca, były pochodzenia egzogennego, czy też zostały wytworzone w sposób naturalny w jego organizmie. Odróżnienie androgenów egzogennych (syntetycznych) od wytwarzanych endogennie stało się możliwe dzięki wprowadzeniu nowej generacji aparatów.
GC/C/IRMS nowa metoda bezpośredniego wykrywania syntetycznego testosteronu i endogennych androgenów.
Udowodnienie przyjmowania preparatów testosteronu, w celu zwiększenia osiągnięć, stało się zasadniczym problemem z chwilą zaliczenia testosteronu przez Komisję Medyczną MKOl do środków dopingowych (1982 rok, po Igrzyskach Olimpijskich w Moskwie).
Przyjęcie w 1983 roku przez Manfreda Dönikego (profesora w Deutschen Sporthochschule w Kolonii), podwyższonej wartości wskaźnika T/Et w analizach GC/MS za kryterium przyjmowania testosteronu w celach dopingowych było pierwszym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu. Chociaż badania populacji sportowców ujawniły, że średnie wartości tego wskaźnika wynoszą 1,0±0,9, to jednak, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników testu, Komisja Medyczna MKOl przyjęła za dopuszczalną wartość T/Et=6, a zatem wszystkie wyniki poniżej tej wartości uznawane są za negatywne. Późniejsze badania wykazały, że przyjęcie powyższych założeń nie eliminuje trudności interpretacyjnych. Okazało się np., że podanie 250 mg testosteronu ośmiu chińskim sportowcom spowodowało podwyższenie wskaźnika T/Et tylko u trzech z nich, utrzymywujące się przez 1 dzień. Reagowali oni więc odmiennie niż sportowcy rasy białej (kaukaskiej). Na tej podstawie wnioskowano, że u sportowców pochodzenia azjatyckiego mogą występować wyniki fałszywie ujemne.
Skutecznym sposobem obniżania T/Et poniżej dopuszczalnej wartości okazało się jednoczesne przyjmowanie epitestosteronu z preparatami testosteronu. Tak więc istniała również możliwość fałszowania wyników tego badania.
Z drugiej strony, wartości wskaźnika T/Et powyżej 6, mające wskazywać na przyjmowanie egzogennego testosteronu, mogą być efektem naturalnego zmniejszenia wydalania epitestosteronu. Z tego względu Komisja Medyczna MKOl dopuszczalną graniczną wartość tego wskaźnika podniosła do 10, zaś wyniki pomiędzy 6 a 10 podlegały weryfikacji poprzez dalsze badania (endokrynologiczne).
Okazało się ponadto, że na wzrost T/Et mogą wpływać również takie czynniki, jak: spożycie alkoholu (zwłaszcza u kobiet), nieodpowiednie przechowywanie próbek i rozwój pewnych szczepów flory bakteryjnej w moczu (4), a więc czynniki zupełnie nie związane z przyjmowaniem syntetycznych preparatów testosteronu. Wszystko to sprawiło, że udowodnienie przyjmowania testosteronu w celach dopingowych, nawet przy wysokich wartościach wskaźnika T/Et, stało się problematyczne (odszkodowawcze procesy cywilne z reguły kończyły się wygraną sportowców, oskarżonych o doping).
Żeby przełamać ten impas, nasiliły się poszukiwania metod bardziej skutecznych. Takim rozwiązaniem okazała się nowa metoda, wykorzystująca urządzenie, nazywane w skrócie GC/C/IRMS. Składa się ono z chromatografu gazowego (gas chromatography - GC) sprzężonego z komorą spalania (combustion - C) oraz spektrometrem masowym (mass spectrometry - MS) i umożliwia bezpośrednie wykrywanie syntetycznych androgennych hormonów w analizowanych próbkach moczu sportowców. Badanie oparte jest na tym, że syntetyczny testosteron zawiera mniejszą ilość izotopu węgla 13C niż hormon naturalny, powstający w organizmie. Określenie stosunku izotopów węgla 13C/12C, pochodzącego z testosteronu wyizolowanego z badanej próbki moczu, pozwala ustalić, czy jest to hormon naturalny, czy też syntetyczny.
W komorze spalania w wysokiej temperaturze (+850°C) dochodzi do spalenia wyizolowanego związku (np. testosteronu) do podstawowych składników H2O i CO2. Węgiel powstały z CO2 jest następnie analizowany w spektrometrze masowym, wyposażonym w detektor izotopowy, który pozwala na oznaczenie stosunku izotopów węgla 13C/12C (Isotope Ratio Mass Spectrometry - IRMS).
W pierwszym etapie analizy w chromatografie gazowym następuje rozdział badanego materiału i wyizolowanie, w określonym czasie retencji, _piku_ testosteronu lub innych interesujących nas związków endogennych androgenów, (które następnie podlegają spaleniu w komorze spalania do H2O i CO2).
W detektorze IRMS określa się stosunek 13C/12C w promilach, wobec wzorcowego gazu o standaryzowanym stosunku 13C/12C. Analiza ta wymaga dokładnego oczyszczenia izolowanego piku testosteronu, którego stężenie powinno wynosić około 50ng. Procedura badawcza wymaga więc wstępnego zagęszczenia próbki moczu i izolowania testosteronu na kolumnach chromatografu cieczowego wysokociśnieniowego (HPLC).
Jak ustalono w drodze badań eksperymentalnych, podanie 1 tabletki 40 mg preparatu testosteronu (Andriol) powodowało wzrost T/Et powyżej 6, który utrzymywał się do 2 godzin, za wynik 13C/12C, wskazujący na przyjęcie egzogennego testosteronu, utrzymywał się do 10 godzin (mimo powrotu wskaźnika T/Et do wartości prawidłowej). Badanie tą metodą pozwala na wykrycie stosowania egzogennego testosteronu. Nawet u osób z wrodzonym niskim poziomem wskanika T/Et (np. u Azjatów). Natomiast podwyższenie wskaźnika T/Et do wartości 14,7 nie zawsze znajdowało potwierdzenie w analizach GC/C/IRMS, które dawały wynik całkowicie negatywny.
Oznaczanie wskaźnika T/Et należy więc uznać za badanie wstępne (skryningowe). W przypadku przekroczenia wartości 6,0 Komisja Antydopingowa może rozszerzyć badanie próbki B o wykonanie dodatkowego testu, określającego stosunek izotopów węgla 13C/12C (IRMS). Wynik ten będzie podstawą ostatecznej oceny badania antydopingowego. Badanie to zastępuje uprzednio wykonywany w tych przypadkach test ketokonazolowy. Pozwala także rozstrzygnąć, czy wysoki poziom epitestosteronu, stosowanego w celu maskowania przyjmowania testosteronu i utrzymujący wartość wskaźnika T/Et w granicach prawidłowych, jest pochodzenia egzogennego, czy też jest naturalnie wytwarzany w organizmie sportowca.
Wysoka cena aparatu GC/C/IRMS (około 200 000 dolarów amerykańskich) oraz pracochłonna procedura przygotowania próbki i przeprowadzenia analizy nie pozwalają na zastosowanie tej metody do rutynowych analiz. Wyniki oznaczeń, uzyskiwane przy użyciu tej metody, stanowią ważny dowód w procesach sądowych, w toku których dochodzi do częstego podważania materiału
dowodowego. W obowiązującym w latach 2001-2002 wykazie zakazanych farmakologicznych klas środków i metod dopingu, podanym
w Aktualnym Dodatku A Kodu Antydopingowego MKOl z 1 września 2001 roku, zmieszczono następującą uwagę: W celu podjęcia ostatecznych decyzji, w przypadkach podejrzenia stosowania testosteronu, lub innych endogennych androgenów, należy brać pod uwagę zarówno wyniki zaburzeń profilu steroidowego w moczu, jak i pomiar stosunku izotopów.
Warto pamiętać, że izotopy to związki o tej samej liczbie protonów, ale różnej neutronów. W przyrodzie występują trzy naturalne izotopy węgla: 12C (sześć protonów i sześć neutronów) z częstością występowania około 98,9%, 13C (sześć protonów i siedem neutronów) w stężeniu 1,1% oraz 14C (sześć protonów i osiem neutronów), czas półtrwania wynosi 5760 lat i jest używany do obliczenia wielu znalezisk archeologicznych.
Chromatograf gazowy sprzężony z detektorem wysokiej rozdzielczości - GC/HRMS
W analizach antydopingowych bardzo istotnym elementem diagnostycznym, decydującym o możliwościach wykrywania zakazanych środków w badanych próbkach moczu sportowców, jest wysoka czułość analityczna instrumentów badawczych, czyli zdolność do wykrycia najmniejszej ilości danego związku. Dotyczy to zwłaszcza wykrywania metabolitów steroidów anaboliczno-androgennych. Przerwa w przyjmowaniu tych środków na długo przed spodziewaną kontrolą antydopingową, przeprowadzaną np. w czasie zawodów lub podczas zgrupowań treningowych, sprawia, że stężenia tych metabolitów mogą być bardzo niewielkie, a ich wykrycie zwykłymi metodami wręcz niemożliwe.
Wprowadzenie do analiz antydopingowych aparatu o nazwie GC/HRMS (chromatograf gazowy sprzężony z detektorem mas o wysokiej rozdzielczości) pozwoliło na wykrywanie śladowych ilości metabolitów steroidów anabolicznych, nawet po dłuższej niż miesiąc przerwie w przyjmowaniu tych preparatów. Dotyczy to zwłaszcza związków anabolicznych, takich jak metandienon,
stanozolol, metylotestosteron i clenbuterol, których metabolity długo utrzymują się w organizmie.
Od czasu wprowadzenia Spektrometrii Mas Wysokiej Rozdzielczości (GC/HRMS) do laboratorium antydopingowego w Kolonii w 1995 roku na 116 pozytywnych próbek aż 75 zidentyfikowano za pomocą tego aparatu. Spośród 28 próbek, w których stwierdzano obecność metabolitów metandienonu, tylko w 7 przypadkach wykryto go tradycyjną metodą GC/MS, za pozostałe potwierdzono wyłącznie metodą HRMS. W badaniach, przeprowadzonych przez Federację Podnoszenia Ciężarów przed Igrzyskami Olimpijskimi w Atlancie w 1996 r. w ponad 40 próbkach, stwierdzono, również za pomocą tej metody, obecność metabolitów steroidów anabolicznych
Wysoka czułość i specyficzność analiz przy bardzo dobrej powtarzalności sprawiły, że aparat HRMS stał się urządzeniem niezbędnym do potwierdzania obecności (zwłaszcza śladowych ilości) metabolitów steroidów anabolicznych we wszystkich podejrzanych próbkach. Bardzo wysoka cena tego aparatu (około 500 000 dolarów) spowodowała poszukiwanie alternatywnych rozwiązań technicznych. W wyniku tych poszukiwań został skonstruowany chromatograf gazowy, sprzężony ze spektrometrem MS/MSn, pozwalający na wielokrotną analizę głównych jonów widma poszczególnego metabolitu i znacznie zwiększający możliwości ich wykrywania. Pozwala on na potwierdzenie obecności śladowych ilości metabolitów steroidów anabolicznych, wykrytych w tradycyjnym aparacie GC/MS.
Zakład Badań Antydopingowych w Instytucie Sportu w Warszawie posiada tego typu aparat o nazwie GCQ Plus, firmy ThermoQuest-Finigan, który spełnia wymogi, stawiane wyposażeniu laboratoriów antydopingowych, ubiegających się
o akredytację MKOl. Aparat ten, poza zwykłą analizą GC/MS, pozwala również na rozbicie wyizolowanego jonu, tzw. jonu prekursora danego związku, na jony potomne, czyli tzw. córki, które są charakterystyczne dla tego związku. Pozwala również na wykrywanie śladowych stężeń metabolitów steroidów anabolicznych rzędu 1 ng lub poniżej w 1 ml moczu.
Wykrywanie metabolitów 5 środków anabolicznych o stężeniach 0,2 ng/ml stało się niezbędnym warunkiem uzyskania akredytacji MKOl przez laboratoria antydopingowe. Są to: clenbuterol oraz metabolity: nandrolonu, metylotestosteronu, metandienonu i stanazololu.
Obniżenie progu detekcji metabolitów nandrolonu wykazało, że mogą one w nieznacznej ilości występować w moczu sportowców w warunkach fizjologicznych, zwłaszcza po wysiłkach. Przepisy Antydopingowe wprowadziły progi (limity) dopuszczalnych stężeń nor-androsteronu, które dla kobiet wynoszą 5 ng/ml, zaś dla mężczyzn 2 ng/ml moczu.
Warto wspomnieć, że w badaniach antydopingowych, przeprowadzonych w Zakładzie Badań Antydopingowych Instytutu Sportu w 2001 r., stwierdzono, że w 15 próbkach stężenie nor-androsteronu wynosiło powyżej 2 ng/ml i wahało się od 2,5 do 350 ng/ml, natomiast w innych 19 stężenie tego metabolitu było poniżej dopuszczalnej granicy, czyli 2 ng/ml. Tylko 2 próbki moczu zostały pobrane poza zawodami. Wyniki te potwierdzają uprzednie obserwacje, że wysiłek fizyczny może mieć wpływ na wydalaną w moczu ilość tego metabolitu.
Chromatograf cieczowy sprzężony z detektorem masowym lub MSn (LC/MS lub LC/MSn)
Trzecią nowością, jaka pojawiła się niedawno w laboratoriach antydopingowych, jest chromatograf cieczowy, sprzężony z detektorem masowym lub MSn (LC/MS lub LC/MSn).
Jak zaznaczylimy wcześniej, wysoka powtarzalność i dokładność analiz stanowią o jakości badań antydopingowych. Połączenie spektrometrii masowej z odpowiednią procedurą chromatograficzną jest metodą z wyboru, charakteryzującą się wysoką czułością, powtarzalnością i specyficznością oraz możliwością oceny ilościowej badanych związków. O ile chromatograf gazowy sprzężony z spektrometrem mas (GC/MS) jest tzw. złotym standardem w analizach lotnych substancji, to do pomiarów nielotnych związków wymagana jest analiza w chromatografie cieczowym (HPLC).
To nowe rozwiązanie techniczne jest połączeniem przez system API (Atmospheric Pressure Ionization) lub ElectroSpray starej, wypróbowanej metody chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej (HPLC) z nowoczesnym detektorem MS (z możliwością wielokrotnej analizy MSn). Pozwoliło to ogromnie zwiększyć zakres detekcji związków o ciężarach masy molekularnej powyżej 1000, a nawet do 100 000 (GC/MS może wykrywać tylko do 1000). Szereg analitycznych parametrów wykrywania zakazanych związków (czułość, powtarzalność, oznaczanie ilościowe oraz łatwość obsługi aparatu) sprawia, że urządzenie to należy do zasadniczego wyposażenia nowoczesnych laboratoriów antydopingowych. Analiza próbek krwi aparatem LC/MS pozwala na wykrycie estrów testosteronu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Analiza LC/MS/MS okazała się także bardzo dobrą metodą oznaczania ß-blokerów w moczu.
Zgodnie z obecnymi przepisami antydopingowymi dopuszczalne stężenia salbutamolu (dozwolonego jedynie w inhalacjach) wynoszą: 100 ng/ml w próbkach moczu, pobranych od sportowców w czasie zawodów i 1000 ng/ml w kontroli poza zawodami. Ilościowe oznaczenia salbutamolu w moczu sportowców, wykonane w LC/MS, dają znacznie lepszą powtarzalność i prostolinijność pomiarów.
Postęp techniczny, jaki dokonał się w analityce chemicznej w ciągu ostatnich dziesięciu lat, sprawił, że wykrywanie oraz identyfikacja substancji chemicznych i farmakologicznych uznanych za dopingowe, przestało praktycznie być problemem. Przed laboratoriami antydopingowy mi staje obecnie nowe wyzwanie wykrywanie dopingu hormonami peptydowymi, wśród nich przede wszystkim erytropoetyny (EPO) i hormonu wzrostu (hGH).
Hormony peptydowe, takie jak rekombinowana egzogenna erytropoetyna (rHuEPO) i rekombinowany hormon wzrostu (rhGH), znalazły się na liście środków zakazanych przez MKOl już w 1989 roku (klasa E), ale dotąd nie było testów, które pozwalały na udowodnienie stosowania ich w celach dopingu przez sportowców. Powodem brak wiarygodnych metod wykrywania oraz identyfikacji syntetycznych hormonów rHuEPO i rhGH. Ostatnio pojawiły się doniesienia o nowej formie EPO (wykazuje znacznie dłuższe i silniejsze działanie) o nazwie Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Synteza nowej formy erytropoetyny o nazwie fabrycznej Darbepoetin alfa, pobudza erytropoezę w szpiku w identyczny sposób, jak naturalnie wytwarzane EPO lub rHuEPO. Modyfikacja cząsteczki EPO, przez dodanie dwóch łańcuchów sialowych (z jednoczesną zamianą 5 aminokwasów na cząsteczki węglowodanów) powoduje 3,5-krotne wydłużenie czasu jej półtrwania w organizmie. Pozwala to na ograniczenie podawania tego hormonu w leczeniu pacjentów z niedokrwistością.
Erytropoetyna jest hormonem glikoproteinowej (składającym się ze 165 aminokwasów i komponenty węglowodanowej), wytwarzanym przez nerki, który reguluje prawidłowy poziom masy krwinek czerwonych w organizmie. Rekombinowany ludzki hormon EPO (rHuEPO) i syntetyczna erytropoetyna okazała się lekiem bardzo skutecznym i dobrze tolerowanym, nieodzownym w terapii niedokrwistości dializowanych chorych z przewlekłą niewydolnością nerek, w ciężkiej niedokrwistości w przebiegu chemioterapii nowotworów, jak też w leczeniu AIDS. Terapia rHuEPO wymaga jednak częstych, do trzech razy w tygodniu, wstrzyknięć tego preparatu.
Stosowanie rHuEPO lub nowej formy tego hormonu NESP stało się atrakcyjnym i skutecznym sposobem zwiększenia zdolności organizmu sportowców do jeszcze wyższych osiągnięć (wzrost transportu tlenu do mięni), zwłaszcza w dyscyplinach wytrzymałościowych. Metody wykrywania rekombinowanej egzogennej formy rHuEPO, zaproponowane w programie EPO Sydney
2000, będą stosowane podczas kontroli antydopingowej w czasie najbliższych Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Salt Lake City.
Badania te opierają się na dwóch rodzajach testów:
- bezpośrednich, różnicujących struktury obu hormonów w próbkach moczu na podstawie ich niejednorodności,
- pośrednich, czyli oznaczaniu tzw. markerów osocza krwi, których zmiany są efektem działania hormonu.
Metody bezpośrednie polegają na analizie zachowań obu postaci hormonów w rozdziale elektroforetycznym. W polu elektrycznym poruszają się one z różną szybkością. Porównanie układu (około 10 pasm-widm) izoform naturalnego hormonu EPO (bardziej kwaśne) z izoformami rHuEPO (bardziej zasadowe) pozwala na odróżnienie rekombinowanej rHuEPO od naturalnej EPO. Uzyskane wyniki badań próbek moczu lub surowicy porównuje się z równocześnie przeprowadzonymi analizami układu izoform: czystej naturalnej erytropoetyny, preparatów rekombinowanej rHuEPO oraz próbek kontrolnych.
Przydatność tej metody jako kryterium dowodowego stosowania dopingu erytropoetyną mogą potwierdzają retrospektywne badania uczestników kolarskiego Wyścigu Dookoła Francji w 1998 roku. U 14 spośród 102 zawodników stwierdzono podwyższenie poziomu EPO we krwi. W analizach elektroforetycznych 14 próbek moczu, pobranych od tych samych zawodników, stwierdzono układ izoform typowy dla rekombinowanej rHuEPO.
Późniejsze badania potwierdziły użyteczność tej metody w różnicowaniu syntetycznej i naturalnej erytropoetyny w moczu. Krótki czas półtrwania erytropoetyny powoduje, że już po 48-72 godzinach nie stwierdza się śladu rHuEPO w moczu.
Dlatego też przeprowadza się oznaczanie tzw. markerów osocza krwi, które wskazują dłuższe utrzymywanie się efektów działania przyjętego hormonu. Do markerów tych zalicza się oznaczenia przeprowadzane we krwi, jak: poziom hematokrytu, retikulocytów, % makrocytów (dużych erytrocytów) oraz w surowicy: poziomy rozpuszczalnego receptora transferyny (sTFR), ferrytyny oraz erytropoetyny. Uważa się, że ta grupa markerów odznacza się swoistością i specyficznością diagnostyczną, pozwalającą wyróżnić osoby przyjmujące rHuEPO. Ponadto opracowano specjalne modele diagnostyczne wyników tych oznaczeń, potwierdzających stosowanie rHuEPO (ON-MODEL) i zestaw wyników, wykluczających przyjmowanie tego hormonu (OFF-MODEL).
W ramach programu współpracy MKOl i rządu australijskiego dokonano analizy wiarygodności (walidacji) testów pośrednich oraz określenia prawidłowych wartości tych markerów w grupie osób, uprawiających sporty rekreacyjne, pochodzących z różnych krajów europejskich, azjatyckich oraz z Australii. Analizowano wpływ płci, wieku oraz zmienność osobniczą i wynikającą z stosowania różnych metod oznaczeń. Wyniki analiz próbek krwi i moczu wielokrotnie pobieranych w 1100-osobowej grupie ochotników, pochodzących z 12 krajów, pozwoliły na ocenę wiarygodności tych testów. Badania potwierdziły, że stosowanie rHuEPO powoduje określone i powtarzalne zmiany hematologiczne jednakowe u sportowców, pochodzących z różnych kontynentów. Badania oznaczania poziomów tych markerów są stosunkowo proste i wykonuje się je metodami enzymo-immunologicznymi w aparatach hematologicznych (m. in. ADIVA 120 Hematological Analyser firmy BAYER).
Zwraca się jednak uwagę, że stosowanie preparatu rHuEPO wraz z dożylnymi wstrzyknięciami żelaza, praktykowane przez niektórych sportowców, może modyfikować uzyskiwane wyniki. Obniża to poziom rozpuszczalnych receptorów transferyny, jednego z ważnych testów potwierdzających stosowanie rHuEPO. Dlatego zaleca się, ażeby u zawodników z wysokimi poziomami ferrytyny przeprowadzać testy dwukrotnie (przed i po sezonie zawodów) w celu wykluczenia możliwości wahań indywidualnych (wewnątrzosobnicznych).
Inną metodą maskowania efektów stosowania preparatów rHuEPO jest zwiększenie objętości osocza krwi z jednoczesnym rozrzedzeniem jej składników, co powoduje obniżenie poziomów m. in. hemoglobiny, hematokrytu i innych markerów.
Najczęściej stosowane są wstrzyknięcia dożylne preparatu skrobi hydroksyetanolowej (hydroxyethyl starch - HES). Podczas Mistrzostw wiata (Lahti, luty 2001 r.) stwierdzono, że niektórzy norwescy narciarze stosowali ten preparat. Metoda GC/MS pozwala na jednoznaczne stwierdzenie obecności metabolitów HES w moczu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Warto
przy tym zaznaczyć, że preparat HES może być przyczyną ostrej niewydolności nerek. Od stycznia 2000 roku stosowanie substancji, zwiększających objętość osocza, zostało zakazane i weszły na listę metod dopingu.
Wykorzystywanie substytutów krwi, jak też sztucznych przenośników tlenu, m.in. roztworów modyfikowanej hemoglobiny (krwi bydlęcej, pozbawionej składników komórkowych - HBOC-201) lub emulsji tetrafluorowęgla (perfluorocarbon-PFC) jest również zakazane, a ich wykrycie jest stosunkowo proste.
Współczesne metody wykrywania dopingu hormonem wzrostu (hGH)
Podobne jak w przypadku EPO w procedurach, wykrywających stosowanie preparatów hormonu wzrostu, wyróżnia się dwie metody:
- bezpośrednią: immunologiczną, pozwalającą na odróżnienie izomerów pochodzenia przysadkowego, naturalnie wytwarzanego hGH, od monomeru rekombinowanego egzogennego hormonu wzrostu rhGH,
- pośrednie: oznaczające poziom markerów surowicy krwi, które wiadczą o dłużej utrzymujących się efektach działania tego hormonu.
Obie metody wymagają pobierania próbek krwi.
W przypadku pierwszej metody tzw. okno wykrycia wynosi 24 godziny od wstrzyknięcia preparatu rhGH, a ponadto wysiłek fizyczny ma wpływ na wynik badania, dlatego powinno być ono przeprowadzane rano przed treningiem i zawodami.
Podwyższone wyniki markerów działania rhGH utrzymują się przez okres około 2 tygodni i są wyższe u mężczyzn niż u kobiet. Na wyniki tych testów nie ma wpływu nawet bardzo intensywny wysiłek fizyczny. Dlatego mogą być przeprowadzane u zawodnika zaraz po zakończeniu zawodów sportowych.
Podstawą interpretacji wyników testu bezpośredniego jest stwierdzenie, że przysadkowy hormon wzrostu w surowicy zawiera różne molekularne izofomy: 22-kDa-GH i 20 kDa-GH. Izomer 20 kDa, normalnie znajdujący się w surowicy 10% izomeru 22 kDa-GH. Brak izomeru 20 kDa-GH, a obecność wyłącznie 22 kDa-GH, świadczy o podaniu rhGH. Badanie nie pozwala na wykrycie, czy podane zostały preparaty naturalnego przysadkowego hormonu lub hormonu uwalniającego hormon wzrostu (GHRH).
Podstawą badań pośrednich dopingu z użyciem rhGH są zmiany określonych parametrów regulowanych przez naturalny hormon. Wykrycie stosowania rhGH jest możliwe, gdy stwierdza się wzrost poziomu (powyżej normy) GH-zależnych markerów. Do markerów hGH należą 4 markery pochodzenia wątrobowego: IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu); białko 2-wiążące IFG-1 (IGF-2BG); białko 3-wiążące IGF1 (IGF-3BG); ALS (acid labile sub-unit) oraz 4 markery pochodzenia kostnego: osteokalcina, prokolagen typ III (P-III-P), telepeptyd kolagenu I i propeptyd c-końcowego kolagenu typ I (8,19). Dokładne badania, przeprowadzone na 100 ochotnikach przed, w czasie i w 3 miesiące od zaprzestania podawania rhGH, wykazały, że dla odróżnienia grup, otrzymujących rhGH i placebo, wystarczy oznaczenie dwóch markerów IGF-1 i prokolagenu typ III (P-III-P). Badania wykazały też bardzo dobrą stabilność i powtarzalność oznaczeń ww. markerów podczas ich przechowywania (19).
Czułość diagnostyczną powyższych testów, świadczących o stosowaniu dopingu z użyciem rhGH, ocenia się na ponad 90%, z prawdopodobieństwem mniejszym niż 1:10 000, że tego dopingu nie stosowano. Należy podkreślić, że analiza dyskryminacyjna wyników przeprowadzonych testów wypada znacznie gorzej u kobiet niż u mężczyzn czułość diagnostyczna tych testów jest u nich znacznie niższa.
Reasumując, należy podkreślić, że postęp techniczny, instrumentalny i analityczny, poparty osiągnięciami nauk podstawowych (farmakologii, fizjologii i patologii) i klinicznych, pozwala na coraz szybsze, dokładniejsze i niezawodne wykrywanie oraz identyfikację środków i metod dopingu w sporcie. Coraz mniej pozostaje białych plam, czyli tzw. niewykrywalnych środków w programach antydopingowych, z powodu braku właściwych metod, za pomocą których można jednoznacznie dowieść stosowania dopingu.
Krzysztof Chrostowski - Postępy diagnostyki antydopingowej
Precyzyjne wykrywanie oraz identyfikacja niedozwolonych środków dopingujących w organizmie sportowców, uczestniczących w zawodach (a także wyrywkowo, w trakcie kontroli poza zawodami), jest zasadniczym elementem współczesnego systemu przeciwdziałania dopingowi w sporcie. Wynika to z przyjętej obecne definicji dopingu, według której podstawowym kryterium diagnostycznym i dowodowym stosowania niedozwolonych środków jest stwierdzenie w moczu sportowca określonego związku lub jego metabolitu, bądź też przekroczenie dopuszczalnego progu (limitu) jego stężenia. Obecnie w laboratoriach antydopingowych, poza analizami moczu, przeprowadzane są również badania próbek krwi i innych materiałów badawczych (np. włosów).
Stąd też wynikają wysokie wymagania stawiane badaniom, prowadzonym w laboratoriach antydopingowych, oraz dążenie do stałego udoskonalania metod wykrywania oraz identyfikacji zakazanych związków.
Wysiłki zmierzające w tym kierunku przyniosły, w ciągu ostatnich lat, szereg nowych rozwiązań w dziedzinie techniki instrumentalnej i analitycznej. Dzięki temu znacznie rozszerzyły się możliwości badań analitycznych, a uzyskane wyniki stały się wiarygodne. Warto przeto, choćby pobieżnie, zapoznać się z aparaturą badawczą nowej generacji, stanowiącą zasadnicze wyposażenie czołowych laboratoriów antydopingowych. Spośród nowych rozwiązań i innowacji technicznych pragnę ukazać trzy rodzaje aparatów, których zastosowanie okazało się wyjątkowo korzystne.
Jednym z trudniejszych problemów, które należało rozwiązać w toku badań antydopingowych było rozróżnienie endogennych androgenów, takich jak testosteron, dihydrotestosteron (DHT) i dehydroepianarosteron (DHEA), od ich syntetycznych pochodnych, stosowanych w celach dopingowych. Na podstawie wyników rutynowych analiz antydopingowych nie można było rozstrzygnąć, czy związki, ujawnione w moczu badanego sportowca, były pochodzenia egzogennego, czy też zostały wytworzone w sposób naturalny w jego organizmie. Odróżnienie androgenów egzogennych (syntetycznych) od wytwarzanych endogennie stało się możliwe dzięki wprowadzeniu nowej generacji aparatów.
GC/C/IRMS nowa metoda bezpośredniego wykrywania syntetycznego testosteronu i endogennych androgenów.
Udowodnienie przyjmowania preparatów testosteronu, w celu zwiększenia osiągnięć, stało się zasadniczym problemem z chwilą zaliczenia testosteronu przez Komisję Medyczną MKOl do środków dopingowych (1982 rok, po Igrzyskach Olimpijskich w Moskwie).
Przyjęcie w 1983 roku przez Manfreda Dönikego (profesora w Deutschen Sporthochschule w Kolonii), podwyższonej wartości wskaźnika T/Et w analizach GC/MS za kryterium przyjmowania testosteronu w celach dopingowych było pierwszym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu. Chociaż badania populacji sportowców ujawniły, że średnie wartości tego wskaźnika wynoszą 1,0±0,9, to jednak, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników testu, Komisja Medyczna MKOl przyjęła za dopuszczalną wartość T/Et=6, a zatem wszystkie wyniki poniżej tej wartości uznawane są za negatywne. Późniejsze badania wykazały, że przyjęcie powyższych założeń nie eliminuje trudności interpretacyjnych. Okazało się np., że podanie 250 mg testosteronu ośmiu chińskim sportowcom spowodowało podwyższenie wskaźnika T/Et tylko u trzech z nich, utrzymywujące się przez 1 dzień. Reagowali oni więc odmiennie niż sportowcy rasy białej (kaukaskiej). Na tej podstawie wnioskowano, że u sportowców pochodzenia azjatyckiego mogą występować wyniki fałszywie ujemne.
Skutecznym sposobem obniżania T/Et poniżej dopuszczalnej wartości okazało się jednoczesne przyjmowanie epitestosteronu z preparatami testosteronu. Tak więc istniała również możliwość fałszowania wyników tego badania.
Z drugiej strony, wartości wskaźnika T/Et powyżej 6, mające wskazywać na przyjmowanie egzogennego testosteronu, mogą być efektem naturalnego zmniejszenia wydalania epitestosteronu. Z tego względu Komisja Medyczna MKOl dopuszczalną graniczną wartość tego wskaźnika podniosła do 10, zaś wyniki pomiędzy 6 a 10 podlegały weryfikacji poprzez dalsze badania (endokrynologiczne).
Okazało się ponadto, że na wzrost T/Et mogą wpływać również takie czynniki, jak: spożycie alkoholu (zwłaszcza u kobiet), nieodpowiednie przechowywanie próbek i rozwój pewnych szczepów flory bakteryjnej w moczu (4), a więc czynniki zupełnie nie związane z przyjmowaniem syntetycznych preparatów testosteronu. Wszystko to sprawiło, że udowodnienie przyjmowania testosteronu w celach dopingowych, nawet przy wysokich wartościach wskaźnika T/Et, stało się problematyczne (odszkodowawcze procesy cywilne z reguły kończyły się wygraną sportowców, oskarżonych o doping).
Żeby przełamać ten impas, nasiliły się poszukiwania metod bardziej skutecznych. Takim rozwiązaniem okazała się nowa metoda, wykorzystująca urządzenie, nazywane w skrócie GC/C/IRMS. Składa się ono z chromatografu gazowego (gas chromatography - GC) sprzężonego z komorą spalania (combustion - C) oraz spektrometrem masowym (mass spectrometry - MS) i umożliwia bezpośrednie wykrywanie syntetycznych androgennych hormonów w analizowanych próbkach moczu sportowców. Badanie oparte jest na tym, że syntetyczny testosteron zawiera mniejszą ilość izotopu węgla 13C niż hormon naturalny, powstający w organizmie. Określenie stosunku izotopów węgla 13C/12C, pochodzącego z testosteronu wyizolowanego z badanej próbki moczu, pozwala ustalić, czy jest to hormon naturalny, czy też syntetyczny.
W komorze spalania w wysokiej temperaturze (+850°C) dochodzi do spalenia wyizolowanego związku (np. testosteronu) do podstawowych składników H2O i CO2. Węgiel powstały z CO2 jest następnie analizowany w spektrometrze masowym, wyposażonym w detektor izotopowy, który pozwala na oznaczenie stosunku izotopów węgla 13C/12C (Isotope Ratio Mass Spectrometry - IRMS).
W pierwszym etapie analizy w chromatografie gazowym następuje rozdział badanego materiału i wyizolowanie, w określonym czasie retencji, _piku_ testosteronu lub innych interesujących nas związków endogennych androgenów, (które następnie podlegają spaleniu w komorze spalania do H2O i CO2).
W detektorze IRMS określa się stosunek 13C/12C w promilach, wobec wzorcowego gazu o standaryzowanym stosunku 13C/12C. Analiza ta wymaga dokładnego oczyszczenia izolowanego piku testosteronu, którego stężenie powinno wynosić około 50ng. Procedura badawcza wymaga więc wstępnego zagęszczenia próbki moczu i izolowania testosteronu na kolumnach chromatografu cieczowego wysokociśnieniowego (HPLC).
Jak ustalono w drodze badań eksperymentalnych, podanie 1 tabletki 40 mg preparatu testosteronu (Andriol) powodowało wzrost T/Et powyżej 6, który utrzymywał się do 2 godzin, za wynik 13C/12C, wskazujący na przyjęcie egzogennego testosteronu, utrzymywał się do 10 godzin (mimo powrotu wskaźnika T/Et do wartości prawidłowej). Badanie tą metodą pozwala na wykrycie stosowania egzogennego testosteronu. Nawet u osób z wrodzonym niskim poziomem wskanika T/Et (np. u Azjatów). Natomiast podwyższenie wskaźnika T/Et do wartości 14,7 nie zawsze znajdowało potwierdzenie w analizach GC/C/IRMS, które dawały wynik całkowicie negatywny.
Oznaczanie wskaźnika T/Et należy więc uznać za badanie wstępne (skryningowe). W przypadku przekroczenia wartości 6,0 Komisja Antydopingowa może rozszerzyć badanie próbki B o wykonanie dodatkowego testu, określającego stosunek izotopów węgla 13C/12C (IRMS). Wynik ten będzie podstawą ostatecznej oceny badania antydopingowego. Badanie to zastępuje uprzednio wykonywany w tych przypadkach test ketokonazolowy. Pozwala także rozstrzygnąć, czy wysoki poziom epitestosteronu, stosowanego w celu maskowania przyjmowania testosteronu i utrzymujący wartość wskaźnika T/Et w granicach prawidłowych, jest pochodzenia egzogennego, czy też jest naturalnie wytwarzany w organizmie sportowca.
Wysoka cena aparatu GC/C/IRMS (około 200 000 dolarów amerykańskich) oraz pracochłonna procedura przygotowania próbki i przeprowadzenia analizy nie pozwalają na zastosowanie tej metody do rutynowych analiz. Wyniki oznaczeń, uzyskiwane przy użyciu tej metody, stanowią ważny dowód w procesach sądowych, w toku których dochodzi do częstego podważania materiału
dowodowego. W obowiązującym w latach 2001-2002 wykazie zakazanych farmakologicznych klas środków i metod dopingu, podanym
w Aktualnym Dodatku A Kodu Antydopingowego MKOl z 1 września 2001 roku, zmieszczono następującą uwagę: W celu podjęcia ostatecznych decyzji, w przypadkach podejrzenia stosowania testosteronu, lub innych endogennych androgenów, należy brać pod uwagę zarówno wyniki zaburzeń profilu steroidowego w moczu, jak i pomiar stosunku izotopów.
Warto pamiętać, że izotopy to związki o tej samej liczbie protonów, ale różnej neutronów. W przyrodzie występują trzy naturalne izotopy węgla: 12C (sześć protonów i sześć neutronów) z częstością występowania około 98,9%, 13C (sześć protonów i siedem neutronów) w stężeniu 1,1% oraz 14C (sześć protonów i osiem neutronów), czas półtrwania wynosi 5760 lat i jest używany do obliczenia wielu znalezisk archeologicznych.
Chromatograf gazowy sprzężony z detektorem wysokiej rozdzielczości - GC/HRMS
W analizach antydopingowych bardzo istotnym elementem diagnostycznym, decydującym o możliwościach wykrywania zakazanych środków w badanych próbkach moczu sportowców, jest wysoka czułość analityczna instrumentów badawczych, czyli zdolność do wykrycia najmniejszej ilości danego związku. Dotyczy to zwłaszcza wykrywania metabolitów steroidów anaboliczno-androgennych. Przerwa w przyjmowaniu tych środków na długo przed spodziewaną kontrolą antydopingową, przeprowadzaną np. w czasie zawodów lub podczas zgrupowań treningowych, sprawia, że stężenia tych metabolitów mogą być bardzo niewielkie, a ich wykrycie zwykłymi metodami wręcz niemożliwe.
Wprowadzenie do analiz antydopingowych aparatu o nazwie GC/HRMS (chromatograf gazowy sprzężony z detektorem mas o wysokiej rozdzielczości) pozwoliło na wykrywanie śladowych ilości metabolitów steroidów anabolicznych, nawet po dłuższej niż miesiąc przerwie w przyjmowaniu tych preparatów. Dotyczy to zwłaszcza związków anabolicznych, takich jak metandienon,
stanozolol, metylotestosteron i clenbuterol, których metabolity długo utrzymują się w organizmie.
Od czasu wprowadzenia Spektrometrii Mas Wysokiej Rozdzielczości (GC/HRMS) do laboratorium antydopingowego w Kolonii w 1995 roku na 116 pozytywnych próbek aż 75 zidentyfikowano za pomocą tego aparatu. Spośród 28 próbek, w których stwierdzano obecność metabolitów metandienonu, tylko w 7 przypadkach wykryto go tradycyjną metodą GC/MS, za pozostałe potwierdzono wyłącznie metodą HRMS. W badaniach, przeprowadzonych przez Federację Podnoszenia Ciężarów przed Igrzyskami Olimpijskimi w Atlancie w 1996 r. w ponad 40 próbkach, stwierdzono, również za pomocą tej metody, obecność metabolitów steroidów anabolicznych
Wysoka czułość i specyficzność analiz przy bardzo dobrej powtarzalności sprawiły, że aparat HRMS stał się urządzeniem niezbędnym do potwierdzania obecności (zwłaszcza śladowych ilości) metabolitów steroidów anabolicznych we wszystkich podejrzanych próbkach. Bardzo wysoka cena tego aparatu (około 500 000 dolarów) spowodowała poszukiwanie alternatywnych rozwiązań technicznych. W wyniku tych poszukiwań został skonstruowany chromatograf gazowy, sprzężony ze spektrometrem MS/MSn, pozwalający na wielokrotną analizę głównych jonów widma poszczególnego metabolitu i znacznie zwiększający możliwości ich wykrywania. Pozwala on na potwierdzenie obecności śladowych ilości metabolitów steroidów anabolicznych, wykrytych w tradycyjnym aparacie GC/MS.
Zakład Badań Antydopingowych w Instytucie Sportu w Warszawie posiada tego typu aparat o nazwie GCQ Plus, firmy ThermoQuest-Finigan, który spełnia wymogi, stawiane wyposażeniu laboratoriów antydopingowych, ubiegających się
o akredytację MKOl. Aparat ten, poza zwykłą analizą GC/MS, pozwala również na rozbicie wyizolowanego jonu, tzw. jonu prekursora danego związku, na jony potomne, czyli tzw. córki, które są charakterystyczne dla tego związku. Pozwala również na wykrywanie śladowych stężeń metabolitów steroidów anabolicznych rzędu 1 ng lub poniżej w 1 ml moczu.
Wykrywanie metabolitów 5 środków anabolicznych o stężeniach 0,2 ng/ml stało się niezbędnym warunkiem uzyskania akredytacji MKOl przez laboratoria antydopingowe. Są to: clenbuterol oraz metabolity: nandrolonu, metylotestosteronu, metandienonu i stanazololu.
Obniżenie progu detekcji metabolitów nandrolonu wykazało, że mogą one w nieznacznej ilości występować w moczu sportowców w warunkach fizjologicznych, zwłaszcza po wysiłkach. Przepisy Antydopingowe wprowadziły progi (limity) dopuszczalnych stężeń nor-androsteronu, które dla kobiet wynoszą 5 ng/ml, zaś dla mężczyzn 2 ng/ml moczu.
Warto wspomnieć, że w badaniach antydopingowych, przeprowadzonych w Zakładzie Badań Antydopingowych Instytutu Sportu w 2001 r., stwierdzono, że w 15 próbkach stężenie nor-androsteronu wynosiło powyżej 2 ng/ml i wahało się od 2,5 do 350 ng/ml, natomiast w innych 19 stężenie tego metabolitu było poniżej dopuszczalnej granicy, czyli 2 ng/ml. Tylko 2 próbki moczu zostały pobrane poza zawodami. Wyniki te potwierdzają uprzednie obserwacje, że wysiłek fizyczny może mieć wpływ na wydalaną w moczu ilość tego metabolitu.
Chromatograf cieczowy sprzężony z detektorem masowym lub MSn (LC/MS lub LC/MSn)
Trzecią nowością, jaka pojawiła się niedawno w laboratoriach antydopingowych, jest chromatograf cieczowy, sprzężony z detektorem masowym lub MSn (LC/MS lub LC/MSn).
Jak zaznaczylimy wcześniej, wysoka powtarzalność i dokładność analiz stanowią o jakości badań antydopingowych. Połączenie spektrometrii masowej z odpowiednią procedurą chromatograficzną jest metodą z wyboru, charakteryzującą się wysoką czułością, powtarzalnością i specyficznością oraz możliwością oceny ilościowej badanych związków. O ile chromatograf gazowy sprzężony z spektrometrem mas (GC/MS) jest tzw. złotym standardem w analizach lotnych substancji, to do pomiarów nielotnych związków wymagana jest analiza w chromatografie cieczowym (HPLC).
To nowe rozwiązanie techniczne jest połączeniem przez system API (Atmospheric Pressure Ionization) lub ElectroSpray starej, wypróbowanej metody chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej (HPLC) z nowoczesnym detektorem MS (z możliwością wielokrotnej analizy MSn). Pozwoliło to ogromnie zwiększyć zakres detekcji związków o ciężarach masy molekularnej powyżej 1000, a nawet do 100 000 (GC/MS może wykrywać tylko do 1000). Szereg analitycznych parametrów wykrywania zakazanych związków (czułość, powtarzalność, oznaczanie ilościowe oraz łatwość obsługi aparatu) sprawia, że urządzenie to należy do zasadniczego wyposażenia nowoczesnych laboratoriów antydopingowych. Analiza próbek krwi aparatem LC/MS pozwala na wykrycie estrów testosteronu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Analiza LC/MS/MS okazała się także bardzo dobrą metodą oznaczania ß-blokerów w moczu.
Zgodnie z obecnymi przepisami antydopingowymi dopuszczalne stężenia salbutamolu (dozwolonego jedynie w inhalacjach) wynoszą: 100 ng/ml w próbkach moczu, pobranych od sportowców w czasie zawodów i 1000 ng/ml w kontroli poza zawodami. Ilościowe oznaczenia salbutamolu w moczu sportowców, wykonane w LC/MS, dają znacznie lepszą powtarzalność i prostolinijność pomiarów.
Postęp techniczny, jaki dokonał się w analityce chemicznej w ciągu ostatnich dziesięciu lat, sprawił, że wykrywanie oraz identyfikacja substancji chemicznych i farmakologicznych uznanych za dopingowe, przestało praktycznie być problemem. Przed laboratoriami antydopingowy mi staje obecnie nowe wyzwanie wykrywanie dopingu hormonami peptydowymi, wśród nich przede wszystkim erytropoetyny (EPO) i hormonu wzrostu (hGH).
Hormony peptydowe, takie jak rekombinowana egzogenna erytropoetyna (rHuEPO) i rekombinowany hormon wzrostu (rhGH), znalazły się na liście środków zakazanych przez MKOl już w 1989 roku (klasa E), ale dotąd nie było testów, które pozwalały na udowodnienie stosowania ich w celach dopingu przez sportowców. Powodem brak wiarygodnych metod wykrywania oraz identyfikacji syntetycznych hormonów rHuEPO i rhGH. Ostatnio pojawiły się doniesienia o nowej formie EPO (wykazuje znacznie dłuższe i silniejsze działanie) o nazwie Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Synteza nowej formy erytropoetyny o nazwie fabrycznej Darbepoetin alfa, pobudza erytropoezę w szpiku w identyczny sposób, jak naturalnie wytwarzane EPO lub rHuEPO. Modyfikacja cząsteczki EPO, przez dodanie dwóch łańcuchów sialowych (z jednoczesną zamianą 5 aminokwasów na cząsteczki węglowodanów) powoduje 3,5-krotne wydłużenie czasu jej półtrwania w organizmie. Pozwala to na ograniczenie podawania tego hormonu w leczeniu pacjentów z niedokrwistością.
Erytropoetyna jest hormonem glikoproteinowej (składającym się ze 165 aminokwasów i komponenty węglowodanowej), wytwarzanym przez nerki, który reguluje prawidłowy poziom masy krwinek czerwonych w organizmie. Rekombinowany ludzki hormon EPO (rHuEPO) i syntetyczna erytropoetyna okazała się lekiem bardzo skutecznym i dobrze tolerowanym, nieodzownym w terapii niedokrwistości dializowanych chorych z przewlekłą niewydolnością nerek, w ciężkiej niedokrwistości w przebiegu chemioterapii nowotworów, jak też w leczeniu AIDS. Terapia rHuEPO wymaga jednak częstych, do trzech razy w tygodniu, wstrzyknięć tego preparatu.
Stosowanie rHuEPO lub nowej formy tego hormonu NESP stało się atrakcyjnym i skutecznym sposobem zwiększenia zdolności organizmu sportowców do jeszcze wyższych osiągnięć (wzrost transportu tlenu do mięni), zwłaszcza w dyscyplinach wytrzymałościowych. Metody wykrywania rekombinowanej egzogennej formy rHuEPO, zaproponowane w programie EPO Sydney
2000, będą stosowane podczas kontroli antydopingowej w czasie najbliższych Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Salt Lake City.
Badania te opierają się na dwóch rodzajach testów:
- bezpośrednich, różnicujących struktury obu hormonów w próbkach moczu na podstawie ich niejednorodności,
- pośrednich, czyli oznaczaniu tzw. markerów osocza krwi, których zmiany są efektem działania hormonu.
Metody bezpośrednie polegają na analizie zachowań obu postaci hormonów w rozdziale elektroforetycznym. W polu elektrycznym poruszają się one z różną szybkością. Porównanie układu (około 10 pasm-widm) izoform naturalnego hormonu EPO (bardziej kwaśne) z izoformami rHuEPO (bardziej zasadowe) pozwala na odróżnienie rekombinowanej rHuEPO od naturalnej EPO. Uzyskane wyniki badań próbek moczu lub surowicy porównuje się z równocześnie przeprowadzonymi analizami układu izoform: czystej naturalnej erytropoetyny, preparatów rekombinowanej rHuEPO oraz próbek kontrolnych.
Przydatność tej metody jako kryterium dowodowego stosowania dopingu erytropoetyną mogą potwierdzają retrospektywne badania uczestników kolarskiego Wyścigu Dookoła Francji w 1998 roku. U 14 spośród 102 zawodników stwierdzono podwyższenie poziomu EPO we krwi. W analizach elektroforetycznych 14 próbek moczu, pobranych od tych samych zawodników, stwierdzono układ izoform typowy dla rekombinowanej rHuEPO.
Późniejsze badania potwierdziły użyteczność tej metody w różnicowaniu syntetycznej i naturalnej erytropoetyny w moczu. Krótki czas półtrwania erytropoetyny powoduje, że już po 48-72 godzinach nie stwierdza się śladu rHuEPO w moczu.
Dlatego też przeprowadza się oznaczanie tzw. markerów osocza krwi, które wskazują dłuższe utrzymywanie się efektów działania przyjętego hormonu. Do markerów tych zalicza się oznaczenia przeprowadzane we krwi, jak: poziom hematokrytu, retikulocytów, % makrocytów (dużych erytrocytów) oraz w surowicy: poziomy rozpuszczalnego receptora transferyny (sTFR), ferrytyny oraz erytropoetyny. Uważa się, że ta grupa markerów odznacza się swoistością i specyficznością diagnostyczną, pozwalającą wyróżnić osoby przyjmujące rHuEPO. Ponadto opracowano specjalne modele diagnostyczne wyników tych oznaczeń, potwierdzających stosowanie rHuEPO (ON-MODEL) i zestaw wyników, wykluczających przyjmowanie tego hormonu (OFF-MODEL).
W ramach programu współpracy MKOl i rządu australijskiego dokonano analizy wiarygodności (walidacji) testów pośrednich oraz określenia prawidłowych wartości tych markerów w grupie osób, uprawiających sporty rekreacyjne, pochodzących z różnych krajów europejskich, azjatyckich oraz z Australii. Analizowano wpływ płci, wieku oraz zmienność osobniczą i wynikającą z stosowania różnych metod oznaczeń. Wyniki analiz próbek krwi i moczu wielokrotnie pobieranych w 1100-osobowej grupie ochotników, pochodzących z 12 krajów, pozwoliły na ocenę wiarygodności tych testów. Badania potwierdziły, że stosowanie rHuEPO powoduje określone i powtarzalne zmiany hematologiczne jednakowe u sportowców, pochodzących z różnych kontynentów. Badania oznaczania poziomów tych markerów są stosunkowo proste i wykonuje się je metodami enzymo-immunologicznymi w aparatach hematologicznych (m. in. ADIVA 120 Hematological Analyser firmy BAYER).
Zwraca się jednak uwagę, że stosowanie preparatu rHuEPO wraz z dożylnymi wstrzyknięciami żelaza, praktykowane przez niektórych sportowców, może modyfikować uzyskiwane wyniki. Obniża to poziom rozpuszczalnych receptorów transferyny, jednego z ważnych testów potwierdzających stosowanie rHuEPO. Dlatego zaleca się, ażeby u zawodników z wysokimi poziomami ferrytyny przeprowadzać testy dwukrotnie (przed i po sezonie zawodów) w celu wykluczenia możliwości wahań indywidualnych (wewnątrzosobnicznych).
Inną metodą maskowania efektów stosowania preparatów rHuEPO jest zwiększenie objętości osocza krwi z jednoczesnym rozrzedzeniem jej składników, co powoduje obniżenie poziomów m. in. hemoglobiny, hematokrytu i innych markerów.
Najczęściej stosowane są wstrzyknięcia dożylne preparatu skrobi hydroksyetanolowej (hydroxyethyl starch - HES). Podczas Mistrzostw wiata (Lahti, luty 2001 r.) stwierdzono, że niektórzy norwescy narciarze stosowali ten preparat. Metoda GC/MS pozwala na jednoznaczne stwierdzenie obecności metabolitów HES w moczu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Warto
przy tym zaznaczyć, że preparat HES może być przyczyną ostrej niewydolności nerek. Od stycznia 2000 roku stosowanie substancji, zwiększających objętość osocza, zostało zakazane i weszły na listę metod dopingu.
Wykorzystywanie substytutów krwi, jak też sztucznych przenośników tlenu, m.in. roztworów modyfikowanej hemoglobiny (krwi bydlęcej, pozbawionej składników komórkowych - HBOC-201) lub emulsji tetrafluorowęgla (perfluorocarbon-PFC) jest również zakazane, a ich wykrycie jest stosunkowo proste.
Współczesne metody wykrywania dopingu hormonem wzrostu (hGH)
Podobne jak w przypadku EPO w procedurach, wykrywających stosowanie preparatów hormonu wzrostu, wyróżnia się dwie metody:
- bezpośrednią: immunologiczną, pozwalającą na odróżnienie izomerów pochodzenia przysadkowego, naturalnie wytwarzanego hGH, od monomeru rekombinowanego egzogennego hormonu wzrostu rhGH,
- pośrednie: oznaczające poziom markerów surowicy krwi, które wiadczą o dłużej utrzymujących się efektach działania tego hormonu.
Obie metody wymagają pobierania próbek krwi.
W przypadku pierwszej metody tzw. okno wykrycia wynosi 24 godziny od wstrzyknięcia preparatu rhGH, a ponadto wysiłek fizyczny ma wpływ na wynik badania, dlatego powinno być ono przeprowadzane rano przed treningiem i zawodami.
Podwyższone wyniki markerów działania rhGH utrzymują się przez okres około 2 tygodni i są wyższe u mężczyzn niż u kobiet. Na wyniki tych testów nie ma wpływu nawet bardzo intensywny wysiłek fizyczny. Dlatego mogą być przeprowadzane u zawodnika zaraz po zakończeniu zawodów sportowych.
Podstawą interpretacji wyników testu bezpośredniego jest stwierdzenie, że przysadkowy hormon wzrostu w surowicy zawiera różne molekularne izofomy: 22-kDa-GH i 20 kDa-GH. Izomer 20 kDa, normalnie znajdujący się w surowicy 10% izomeru 22 kDa-GH. Brak izomeru 20 kDa-GH, a obecność wyłącznie 22 kDa-GH, świadczy o podaniu rhGH. Badanie nie pozwala na wykrycie, czy podane zostały preparaty naturalnego przysadkowego hormonu lub hormonu uwalniającego hormon wzrostu (GHRH).
Podstawą badań pośrednich dopingu z użyciem rhGH są zmiany określonych parametrów regulowanych przez naturalny hormon. Wykrycie stosowania rhGH jest możliwe, gdy stwierdza się wzrost poziomu (powyżej normy) GH-zależnych markerów. Do markerów hGH należą 4 markery pochodzenia wątrobowego: IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu); białko 2-wiążące IFG-1 (IGF-2BG); białko 3-wiążące IGF1 (IGF-3BG); ALS (acid labile sub-unit) oraz 4 markery pochodzenia kostnego: osteokalcina, prokolagen typ III (P-III-P), telepeptyd kolagenu I i propeptyd c-końcowego kolagenu typ I (8,19). Dokładne badania, przeprowadzone na 100 ochotnikach przed, w czasie i w 3 miesiące od zaprzestania podawania rhGH, wykazały, że dla odróżnienia grup, otrzymujących rhGH i placebo, wystarczy oznaczenie dwóch markerów IGF-1 i prokolagenu typ III (P-III-P). Badania wykazały też bardzo dobrą stabilność i powtarzalność oznaczeń ww. markerów podczas ich przechowywania (19).
Czułość diagnostyczną powyższych testów, świadczących o stosowaniu dopingu z użyciem rhGH, ocenia się na ponad 90%, z prawdopodobieństwem mniejszym niż 1:10 000, że tego dopingu nie stosowano. Należy podkreślić, że analiza dyskryminacyjna wyników przeprowadzonych testów wypada znacznie gorzej u kobiet niż u mężczyzn czułość diagnostyczna tych testów jest u nich znacznie niższa.
Reasumując, należy podkreślić, że postęp techniczny, instrumentalny i analityczny, poparty osiągnięciami nauk podstawowych (farmakologii, fizjologii i patologii) i klinicznych, pozwala na coraz szybsze, dokładniejsze i niezawodne wykrywanie oraz identyfikację środków i metod dopingu w sporcie. Coraz mniej pozostaje białych plam, czyli tzw. niewykrywalnych środków w programach antydopingowych, z powodu braku właściwych metod, za pomocą których można jednoznacznie dowieść stosowania dopingu.
Naprawdę niebezpieczny człowiek nigdy nie grozi.
[ON]
Krzysztof Piekarz
leonstar
